社会上流传这么一句话：孩子不能输在起跑线上；学生不能输在录取线上；城市女人不能输在曲线上；而所有男人不能输在“前列腺”上，可见前列腺对于男人的重要性。男性无不谈“前列腺炎”色变，前列腺炎患者多被尿频、排尿不净、强烈排尿感、小腹疼痛等不适症状所困扰，同时常常伴随阳痿、早泄等性功能障碍，让他们叫苦连天；同时，前列腺炎病程迁延、易复发、难治愈等特性使无数患者为之辗转反侧，难以入眠，严重危害男性健康。慢性前列腺炎发病机制相关的病因和机制目前尚不清楚，也没有有效的治疗方法。通过检测明确诊断对于治疗，尤其是保证患者治疗依从性至关重要。因此，迫切需要一种新颖、有效的诊断方法。
前列腺炎是指前列腺特异性和非特异感染所致的急慢性炎症，从而引起的全身或局部症状。前列腺炎的致病菌以大肠埃希杆菌为主，约占80%，其次为变形杆菌，克雷白杆菌，肠杆菌，假单胞菌属，沙雷菌，革兰阳性菌除肠球菌外很少致病，此外，淋球菌，结核菌，真菌，滴虫亦可导致相关的前列腺炎，沙眼衣原体，解脲支原体和人型支原体等，对前列腺炎的致病作用目前尚有争议，淋菌性前列腺炎发病近年有逐渐增加趋势。前列腺炎的诊断依赖于临床医生对疾病的经验性判断。前列腺炎传统检测方法因为敏感性和检测范围局限等原因，导致临床假设正确的情况下却还是检测不出来。
一．传统微生物检测技术局限性
二．病原宏基因组诊断方法学优势
病原宏基因组诊断方法学优势巨大
撒网捕鱼（mNGS） VS靶向钓鱼（传统方法）
传统方法检测的病原体种类有限，为靶向检测，就像靶向钓鱼，而宏基因组测序（mNGS）为无偏性的检测病原体，就像撒网捕鱼。
三．病原体高通量测序检测定义和原理
高通量测序等分子生物学技术:基于测序技术的临床宏基因组学，通过分析临床标本中微生物的DNA或RNA含量与丰度判断致病菌，显著提高了病原检测的敏感度，缩短了检测时间，对罕见病原菌感染的诊断具有优势，可审慎地用于现有成熟检测技术不能确定的病原体，或经恰当与规范抗感染治疗无效的患者，但检测结果需结合流行病学和临床特征综合评估是否为致病菌。
应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株宏基因组学研究的对象是特定环境中的总DNA，不是某特定的微生物或其细胞中的总DNA，不需要对微生物进行分离培养和纯化，这对我们认识和利用95%以上的未培养微生物提供了一条新的途径。
四．高通量测序解决的临床问题：
1.避免漏检——检测范围广：一次性检测覆盖10000+病原微生物。
2.检测种类多：细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体、螺旋体、立克次体，可检测到常规手段无法检测的病原体。
3.指导精准治疗：检测病原微生物精准到种。
4. 不受抗生素、厌氧环境限制。
5.检测核酸，灵敏度高，灵敏度是PCR的100倍。
6.高通量测序，阳性率高。
7.无需培养，可检测多重感染的情况。
不基于培养，直接从环境/临床样品中提取全部微生物的DNA, 利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。
不需要预先假设，直接提取感染标本中全部微生物的核酸进行高通量测序，通过微生物专用数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物的种属信息，无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等12593种病原体，可以鉴定新发/已知的病原体感染及混合感染。
五．病原体高通量测序检测流程
mNGS检测整体流程：临床医生对疑似感染病人进行标本采集，然后送回实验室进行核酸提取、高通量测序、生物信息分析、报告解读和生成检测报告。
1.生物标本采集要求
（１）病原体培养应在抗菌药物应用前或停药一周后采集标本。
（２）生殖器是开放性器官，标本采集过程中应遵循无菌操作以减少杂菌污染。
（３）沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，采集时尽可能多的取上皮细胞。
2.采集方法
（１）男性尿道分泌物
取样前至少１h 内不要小便。用无菌生理盐水清洗尿道口，用灭菌纱布或棉球擦
干，用男性拭子采取从尿道口溢出的脓性分泌物或将男性拭子插入尿道内２～４cm 取分泌
物，置无菌试管中。如无脓液溢出，可从阴茎的腹面向龟头方向按摩，促使分泌物溢出。
（2）前列腺液：用肥皂和水清洗阴茎头，经直肠前列腺按摩获取前列腺液，用无菌拭子采
集前列腺液。标本置于无菌容器内送检。
（3）精液：受检者应在５天内未排精。清洗尿道口，体外排精，精液置于灭菌容器内送检。
（4）溃疡分泌物：先用生理盐水清洗患处，再用灭菌棉拭子取其边缘或其基底部的分泌物，标本置于灭菌试管内送检。
3.标签及申请单
每份标本都应贴上标签并标明必要信息，在检验申请单上填写有关临床资料。包括患者情况（科室、患者姓名、住院号）、标本情况（标本类型、采集时间等）、和患者临床及用药等信息。
4.样本包装及运输
样本采集后应立即分装到无菌、干燥、洁净塑料冻存管。拧紧管盖，检查无漏液后，用封口膜封好。在管壁上填写样品编码及患者姓名，字迹需清晰，不易被涂擦，并核对患者信息。
短期内送检，样本应置于-20℃以下冰箱暂存；长期保存应立即置于-80℃冰箱保存；送检 RNA 检测仅限-80℃以下保存，禁止反复冻融。采用干冰/冰盒运输。
六．mNGS实验室检测流程
测序平台选择
七．当前mNGS 检测报告和临床解读常用的概念
1.序列数（reads）：指的是匹配到该病原体的序列数目，其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关。Reads 数越高，表示标本中检测到该病原体的可信度越高。reads数相对高低进行阳性结果判断（适合于有菌部位标本）：
▲ 细菌（分枝杆菌、诺卡菌除外）：mNGS检测到细菌（种水平）的reads数是其余所有细菌的10倍以上。
▲ 真菌：mNGS检测到真菌（种水平）的reads数是其余所有真菌的5倍以上（真菌DNA提取含量较低）。
▲ 分枝杆菌：
1）结核分枝杆菌（MTB）：mNGS至少检测到1条属水平的结核分枝杆菌复合群序列（结核分枝杆菌在标本中含量较低，且环境污染可能性极小）；
2）非结核分枝杆菌（NTM）或诺卡菌：mNGS原始细菌列表，属水平或种水平reads数排名top10（环境污染可能性大，需要综合考虑）
2.基因组的覆盖度：表示检测到的该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，覆盖度高表示该微生物全基因组测到的比率高。
3.深度：是指该微生物基因组上某段序列被检测到的次数，深度参数越大表示该微生物被检测到的可靠性越高。
4.离散度：指检测到某病原微生物的序列在该病原微生物基因组上分布的随机性，随机性越高，检测的可信度越高。
5.微生物丰度：指的是该微生物在整个标本中检测到的相同类型微生物中所占的比重，丰度越高表示其在相同类型微生物中所占的比例越高。
通常情况下，某微生物的检出序列数、深度、离散度和基因组覆盖度越高，表示检测到该微生物的可靠性越高。
八．解读依据（综合判断）：
1.检出序列数（检测结果）：降序排列
（检出序列数越高，致病可能性越大）
2.致病性（结果说明）：疾病相关程度
（疾病相关程度越高，致病可能性越大）
*注：病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如怀疑流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等RNA病毒，需要注意送检RNA检测流程。
九．mNGS 结果解读应该注意什么？
1.检出的病原体：检出的病原体只能代表标本中存在这些检出微生物，但不能确定是定植菌、试剂工程菌、背景菌还是致病菌。
2.胞内菌 / 真菌检出率低：胞内感染菌（结核杆菌、军团菌、布鲁菌等）因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低。另外，具有较厚细胞壁的病原体（如真菌），其核酸提取效率较低，导致检出率和敏感性较低。
3.RNA 病原体的检测：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA 病毒的临床检测还存在一定的困难。
4.可靠程度：不同的公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度，覆盖度，丰度，估测浓度，置信度，各有千秋，需要统一。
最重要的参数：1. 病原体；2. 序列数
十．mNGS 结果如何结合临床进行评判？
1.检出的病原体：报告只能给出病原体，是定植菌、背景菌还是致病菌，需要结合临床。
2.有无临床感染证据：有无发热，感染的症状、体征。
3.实验室检查：结合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6，镜检结果，培养结果，血清学检查。
4.结合影像学改变：影像学改变是感染的重要证据。
5.检测方法：mNGS 技术的方法。
不结合临床，NGS报告就是废纸一张
十一.mNGS结果解读和临床应用原则
* 检测报告中提示某种/某些微生物检出序列数较高、排名靠前，表示检测到该病原微生物；在排除背景菌、污染菌和定植菌的情况下，可以考虑该微生物是致病病原体。
* 检测报告中某种/某些胞内菌（如结核、伤寒、布鲁菌）/厚壁菌（如真菌）检出序列数不高，也要考虑其为致病病原体的可能。
* 对于抗生素使用后送检、某些罕见病原体和胞内菌等情况，可能因检出序列数少，不符合报告规则而未在报告中列举，若临床有疑似特定病原体的感染，可以追溯原始数据库进行查询。
* 检测未报告特定病原微生物，并不能排除患者感染某种病原微生物的可能性，如处于检测范围之外的微生物所造成的感染。
* RNA转录本丰度和复杂度更高，同时极易降解，检测要求条件较高，解读 RNA病原体报告时，要结合标本运输和实验室条件等考虑。
* 检测报告目前尚未覆盖耐药基因，得到微生物信息后，可以结合患者的临床特征、当地细菌耐药的流行病学协助指导抗菌药物的选择。
* 对于严重感染、生命体征不稳定的患者，在早期病原体不明确的情况下，进行经验性的广谱抗菌药物治疗，一旦mNGS或者传统病原学获得致病病原体后，针对病原体进行精准治疗，但要密切随访患者的临床表现和治疗效果。
十二.mNGS 众多的阳性结果（一堆病原体）或者阴性结果如何解读？
（一）要注意影响因素：
1.人体微生态菌群。
2.试剂工程菌与背景菌。
3.同源序列比对分配算法。
经过优化升级，可以给出检测结论，锁定目标病原体，结合临床判断。
（二）检测到的众多病原体到底哪个或哪几个是元凶？
1.严格致病病原体：如结核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原体等，可考虑为致病病原。
2.条件致病菌：铜绿、鲍曼、肺克、链球菌等，要看测到的序列数，以及排名，结合临床来判断。
3.多种病原体混合感染：多病原感染，或呼吸道分泌物、肠道分泌物开放体系本身的微生物多样性等原因会导致多种病原体检出；这更需要结合临床进行分析。
4.常见呼吸道定植菌：一般不考虑致病性，除非序列数特别高。
5.罕见、特殊病原体：检索文献，具体分析。
十三.临床应用&进展
1.mNGS在微生物诊断中的临床实践
mNGS诊断感染性疾病的敏感度和特异度为50.7%和85.7%，敏感性高于传统培养（50.7%vs35.2%）（分析和选择标本/病人/病原体种类/判定标准局限所致），尤其是针对MTB、病毒、厌氧菌、诺卡菌和真菌优势明显。
mNGS早期快速报告结果，给临床提供下一步诊断和治疗的线索，尤其是病毒感染时，避免了抗生素的过度使用。
痰标本mNGS的敏感性明显高于传统培养（MTB、曲霉、隐球菌），针对NTM时BALF的敏感性高于痰标本。
抗生素的使用对mNGS影响远小于培养,mNGS敏感性高于传统培养（52.7%vs34.2%）。
2.病原高通量测序动态监测疾病进展
出自上海华山医院
3.宏基因组检测-全面、快速、精准
